Latar Belakang
Antioksidan adalah senyawa yang dapat menetralisir radikal bebas dengan cara menyumbangkan elektronnya pada senyawa radikal bebas. Senyawa antioksidan dapat mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas terhadap sel normal, protein, dan lemak. Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi menjadi antioksidan
endogen (berasal dari dalam tubuh) dan eksogen (berasal dari luar tubuh) (Kumalaningsih, 2007).
Antioksidan endogen merupakan antioksidan yang dapat disintesis oleh tubuh. Contoh dari antioksidan endogen antara lain superoksida dismutase (SOD), katalase, dan peroksidase. SOD merupakan salah satu jenis antioksidan endogen yang mampu mengkatalisis radikal bebas superoksida (•O2) menjadi hidrogen peroksida (H2O2), sehingga SOD disebut sebagai scavenger atau pembersih superoksida (•O2 -).
Antioksidan eksogen merupakan antioksidan yang diperoleh dari luar tubuh.
Antioksidan eksogen dapat diperoleh dari makanan sehari-hari, terutama sayuran, dan buah-buahan yang mengandung vitamin (vitamin A, C, dan E) dan mineral (Zn, dan Se). Vitamin E merupakan antioksidan eksogen yang paling umum digunakan.
Berdasarkan fungsinya, antioksidan dibagi menjadi empat, diantaranya antioksidan
primer, sekunder, tersier, dan oxygen scavenger.
Antioksidan primer adalah antioksidan yang berfungsi untuk mencegah terbentuknya radikal bebas baru, karena kemampuannya untuk merubah radikal bebas yang ada sebelum bereaksi. Contoh antioksidan primer di dalam tubuh manusia adalah enzim superoksida dismutase (SOD). Enzim ini sangat penting sekali, dikarenakan dapat melindungi sel-sel dalam tubuh akibat kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas. Kinerja enzim ini dipengaruhi oleh beberapa mineral seperti Mn, Zn, Cu, dan Se (Kumalaningsih, 2007).
Antioksidan sekunder adalah senyawa penangkap radikal bebas yang mampu
mencegah terjadinya reaksi berantai, sehingga tidak terjadi kerusakan yang lebih hebat. Contoh antioksidan sekunder adalah vitamin C, vitamin E, dan betakaroten. Sedangkan antioksidan tersier merupakan senyawa yang dapat memperbaiki kerusakan sel ataupun jaringan yang disebabkan oleh radikal bebas. Metionin sulfoksidan reduktase merupakan contoh antioksidan tersier yang dapat memperbaiki DNA dalam sel. Oxygen scavenger adalah antioksidan yang dapat mengikat oksigen, sehingga tidak mendukung kelangsungan reaksi oksidasi oleh radikal bebas, misalnya vitamin C (Atmosukarto, 2003).
Berdasarkan cara memperolehnya, antioksidan dibagi menjadi dua, yaitu antioksidan alami dan sintetik. Jenis-jenis antioksidan sintetik yang banyak digunakan diantaranya adalah butylatedhydroxytoluene (BHT), Butylatedhydroxyanysole (BHA), tert-butyl hydroxyl quinon (TBHQ), propylgalatte (PG), nordihidroquairetic acid (NDGA) dan α- tokoferol. Antioksidan sintetik dapat membahayakan kesehatan, contohnya BHA dan BHT yang dapat menyebabkan pembengkakan organ hati .Selain itu, ada juga antioksidan alami, antioksidan alami diperoleh dari sumber-sumber alami seperti tumbuhan, dan dapat tersebar diberbagai bagian tanaman seperti kayu, kulit, akar, daun, bunga, buah, biji, rimpang, dan serbuk (Pratt, 2003). Sebagai mahasiswa teknologi hasil pertanian penting bagi kita untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari beberapa buah buahan.
Tujuan
Tujuan praktikum ini adalah untuk menganalisa aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
II. TINJAUAN PUSTAKA
Antioksidan
Antioksidan adalah zat penghambat reaksi oksidasi akibat radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan asam lemak tak jenuh, membran dinding sel, pembuluh darah, basa DNA, dan jaringan lipid sehingga menimbulkan penyakit . Suatu tanaman dapat memiliki aktivitas antioksi dan apabila mengandung senyawaan yang mampu menangkal radikal bebas seperti fenol dan flavonoid. Radikal bebas adalah suatu molekul atau atom yang mempunyai 1 atau lebih elektron tidak berpasangan. Radikal ini dapat berasal dari atom hidrogen, molekul oksigen, atau ion logam transisi. Senyawa radikal bebas sangat reaktif dan selalu berusaha mencari pasangan elektron agar kondisinya stabil .
Radikal dapat terbentuk secara endogen dan eksogen. Radikal endogen terbentuk dalam tubuh melalui proses metabolism normal di dalam tubuh. Sementara radikal eksogen berasal dari bahan pencemar yang masuk ke dalam tubuh melalui pernafasan, pencernaan, dan penyerapan kulit . Radikal bebas dalam jumlah normal bermanfaat bagi kesehatan misalnya, memerangi peradangan, membunuh bakteri, dan mengendalikan tonus otot polos pembuluh darah serta organ-organ dalam tubuh (Yuwono, 2009).
Sementara dalam jumlah berlebih mengakibatkan stress oksidatif. Keadaan tersebut dapat menyebabkan kerusakan oksidatif mulai dari tingkat sel, jaringan, hingga ke organ tubuh yang mempercepat terjadinya proses penuaan dan munculnya penyakit (Yuwono 2009). Oleh karena itu, antioksidan dibutuhkan untuk dapat menunda atau menghambat reaksi oksidasi oleh radikal bebas.
Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat dibedakan menjadi antioksidan endogen dan eksogen. Antioksidan endogen terdapat secara alamiah dari dalam tubuh sedangkan antiosidan eksogen dari luar tubuh . Antioksidan eksogen sendiri dibedakan menjadi antioksidan alami dan sintetik .
Metode DPPH
Uji Pendahuluan :
Senyawa hasil isolasi ditotolkan di atas plat KLT, kemudian kromatogram dikeringkan dan disemprot dengan larutan DPPH 1 mM dalam metanol. Setelah 30 menit kromatogram diamati, dimana senyawa yang aktif sebagai antioksidan menunjukkan noda kuning dengan latar ungu (Chaca, 2003; Conforti, 2002). Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (λmaks) DPPH: Sebanyak 9 ml metanol p.a. ditambahkan ke dalam 1 ml larutan DPPH 1 mM, dikocok dengan kuat dan disimpan dalam ruang gelap selama 30 menit, kemudian diukur absorbansnya menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Absorbans yang paling besar, dilihat panjang gelombangnya dan dijadikan panjang gelombang maksimum (λmaks).
Penentuan Nilai IC50:
Senyawa hasil isolasi dilarutkan ke dalam metanol p.a. sehingga diperoleh beberapa variasi konsentrasi. Sebanyak 9 ml larutan senyawa hasil isolasi ditambahkan ke dalam 1 ml larutan DPPH 1 mM, dikocok dengan kuat dan disimpan dalam ruang gelap selama 30 menit, kemudian diukur absorbansnya menggunakan spektrofotometer UV-Vis (Vankar, 2006; Molyneux, 2004; Han, 2004). Nilai IC50 dihitung dari interpolasi pada grafik hubungan antara konsentrasi larutan uji dan daya antioksidan, kemudian dibandingkan dengan nilai IC50 larutan standar vitamin C yang dihitung dari interpolasi pada grafik hubungan antara konsentrasi vitamin C dan daya antioksidan. Nilai IC50 merupakan konsentrasi penghambatan 50% terhadap radikal bebas DPPH dari senyawa murni hasil isolasi. Besarnya daya antioksidan dihitung dengan rumus pada persamaan
Daya antioksidan = Absorbans kontrol – Absorbans sampel x 100%
Absorbans kontrol
PELAKSANAAN PRAKTIKUM
Tempat dan Waktu
Praktikum Pangan Fungsional dan Fitokimia dilaksanakan di Laboratorium Kimia Hasil Pertanian Jurusan Teknologi Pertanian Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya. Pada Hari Senin tanggal 7 Oktober 2013 Pukul 11.30 - 13.00 WIB.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam analisa total fenol adalah : l).tseaker celas. 2).Blender. 3).Neraca analitik, 4).Penangas air. 5).Penjepit tabung reaksi. 6).Piper tetes. 7).Rak raburng reaksi. 8).Spatula. 9).Tabung reaksi. Bahan yang digunakan pada praktikum analisa total fenol adalah : l).Aquadest. 2).Etanol 95%. 3).Folin Ciocalteu 50%. .4).Na:COr. 5).Teh Bendera. 6;.Teh cap daun. 7;.Teh kepala jenggot. 8). Teh zeppelin.
Cara kerja
Cara kerja praktikum analisa total fenol ini adalah :
Sebanyak 10 mg sampel uji dilarutkan dengan 2ml etanol 95% dan dikocok dengan vorteS selama- 2 menit.
Sebanyak 0,5 ml campuran sampel dicanrpurkan dengan 0-5ml etanol 95%, dan 2-5 rnl air aquadest.
Folin ciocalteu 50% sebanyak 2,5 ml ditambahakan kedalam campuran sampel
Campuran dihomogenisasi menggunakan vortex dan didiamkan selama 5 menit
Sebanyak 1 ml Na2CO3 ditambahkan kecampuran
Campuran dihomogenisasi dengan vortex. Lalu didiamkan selama 30 menit dalam ruang gelap.
Larutan blanko dibuat sesuai cara kerja tanpa penambahan sampel
Pengukuran absorbansi sampel dan blanko dilakukan dengan spektrofotometer
Pembahasan
Manfaat produk berantioksidan ditentukan oleh tingkat aktivitas antioksidannya. Pengukuran aktivitas antioksidan perlu dilakukan untuk mengetahui seberapa besar potensi antioksidan dari produk intermediet sebelum dan setelah diolah menjadi minuman fungsional. Beragam metode pengukuran telah dikembangkan untuk mengukur karakteristik total antioksidan, tetapi tidak ada yang benar-benar ideal . Metode pengukuran aktivitas antioksidan tersebut akan mendeteksi karakteristik yang berbeda dari antioksidan dalam sampel Hal ini menjelaskan mengapa metode pengukuran aktivitas yang berbeda akan mengacu pada pengamatan mekanisme kerja antioksidan yang berbeda pula (Hasannbaglou, 2012). Pengukuran aktivitas antioksidan dalam menangkal radikal bebas dapat dilakukan dengan bermacam metode seperti DPPH, ORAC, dan ABTS (TEAC). Dalam praktikum ini yang digunakan adalah pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode analisa DPPH.
Kelebihan dari metode pengujian DPPH adalah telah banyak digunakan di dunia dan mudah diterapkan karena senyawa radikal yang digunakan bersifat relatif stabil dibanding metode lainnya. Prinsip dari uji ini adalah adanya donasi atom hidrogen dari substansi yang diujikan kepada radikal DPPH yang ditunjukkan oleh perubahan warna. Menurut Karadag (2009), penentuan aktivitas antioksidan berdasarkan perubahan absorbansi DPPH harus diperhatikan karena absorbansi radikal DPPH setelah bereaksi dengan antioksidan dapat berkurang oleh cahaya, oksigen dan tipe pelarut.Karakter utama senyawa antioksidan adalah kemampuannya untuk menangkap radikal bebas (Prakash, 2001). Pengujian antioksidan menggunakan DPPH adalah dengan cara menghitung seberapa banyak radikal bebas yang berhasil ditahannya atau yang biasa dikenal dengan IC50.
Hasil pngujian dan perhitungan dibuat kurva linear antara konsentrasi larutan uji dengan % peredaman DPPH dan ditentukan harga IC50, yakni konsentrasi larutan uji yang memberikan peredaman DPPH sebesar 50%. Harga IC50 umum digunakan untuk menyatakan aktivitas antioksidan suatu bahan uji dengan metode peredaman radikal bebas DPPH (Molyneux, 2004).
Berdasarkan pada hasil perhitungan IC50 dapat diketahui bahwa yang memperoleh nilai paling tinggi adalah jus mangga sedangkan yang paling rendah adalah jambu biji. Hal ini menunjukkan bahwa mangga memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan sampel uji yang lain karena memiliki daya redam radikal bebas yang cukup tinggi. Sedangkan yang memiliki aktivitas antioksidan yang paling rendah adalah jambu biji karena memiliki nilai redam radikal bebas yang rendah pula.
KESIMPULAN
Dari hasil praktikum yang telah kita lakukan, dapat disimpulkan bahwa :
Antioksidan yang bersumber dari buah buahan disebut juga sebagai antioksidan alami.
Antioksidan dalam buah buahan atau tumbuhan biasanya berupa vitamin
Pengukuran antioksidan menggunakan metode DPPH lebih mudah karena menggunakan senyawa radikan yang lebih stabil
Pengukuran antioksidan berdasarkan pada seberapa banyak radikal bebas yang dapat diredam oleh antioksidan atau dikenal dengan IC50
Aktivitas antioksidan yang paling tinggi adalah pada buah mangga sedangkan yang paling rendah adalah jambu biji.
DAFTAR PUSTAKA
A.H. Yuwono, 2009, Teori dasar pengujian mekanik pada material, Fakultas Teknik Universitas Indonesia, Jakarta.
Atmosukarto.2003.mencegah penyakit degeneratif dengan makanan.cermin dunia kedokteran.140:41-49
Chacha, M., Moleta, G.B., Majinda, R.R.T. 2003. Antimycrobial and Radical Scavenging Flavonoids from the Stem Wood of Erythrina latissima. Phytochemistry,66,99-104
Conforti, F. 2002. Antioxsidant activity of metanolic extract of hypericum Triquetrifolium turra aerial part. Fitoterapia. 73:479-483.
Han LK et al. 2004. “Reduction of fat storage in mice fed a high-fat diet long term by treatment with saponins prepared from Kochia scoparia fruit”. [artikel]. Phytoteraphy Research. 20
(10): 877-882.
Hassanbaglou, B., Hamid, A. A., Roheeyati, A. M., Saleh, N. M., Abdulamir, A. S., Khatib, A., Sabu, M. C. 2012. Antioxidant Activity of Different Extracts From Leaves of Pereskia bleo (Cactaceae), Journal of Medicinal Plants Research Vol. 6 (15): 2932-2937
Karadag, A. Ozcelik, B., Saner, S. 2009. Review of Methods to Determine Antioxidant Capacities, Food Analytical Methods Vol. 2:41-60.
Kumalaningsih. 2007. Antioksidan Alami Penangkal Radikal Bebas. Trubus Agrisarana. Surabaya.
Molyneux P. 2004. The use of the stabel free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin Journal Science Technology. 26(2): 211-219.
Prakash, S.2001.proverty and inveroment Linkages: Reflection on the proverty trap thesis. CREED working paper No 12, february, 1997.
Pratt.2003.Naturall antioxidant not commercially.didalam BJF Hudson.Editor, London: Elsevier Alphed Science.
Vankar, P.S., Tiwari, V., Singh, L.W., Swapana, N., 2006, ”Antioxidant Properties of Some Exclusive Species of Zingiberaceae Family of Manipur”, EJEAFChe, 5(2), 1318-1322.